Калькулятор концентрации ДНК

Нуклеиновые кислоты сильно поглощают ультрафиолет около 260 нанометров благодаря ароматическим основаниям. Спектрофотометр измеряет оптическую плотность, а закон Бугера — Ламберта — Бера связывает ее с концентрацией. Калькулятор применяет принятые лабораторные коэффициенты для двухцепочечной ДНК, одноцепочечной ДНК и РНК. Затем он умножает результат на коэффициент разведения и объем образца, выдавая концентрацию и общую выделенную массу. Значение A260, равное 1.0, обычно принимают за 50 микрограммов на миллилитр для двухцепочечной ДНК, 33 микрограмма на миллилитр для одноцепочечной ДНК или 40 микрограммов на миллилитр для РНК. Микрограммы на миллилитр численно равны нанограммам на микролитр, поэтому дополнительный пересчет масштаба не нужен. При измерении разведенного образца умножьте на коэффициент разведения. Например, двухцепочечная ДНК с A260 0.5 после десятикратного разведения имеет исходную концентрацию 250 нанограммов на микролитр. Точность зависит от правильной поправки на холостой образец, чистой оптической поверхности и показания в линейном диапазоне прибора. Для холостой пробы используйте тот же буфер, поскольку соли, pH и другие компоненты могут менять базовую линию. Осторожно перемешайте образец и избегайте пузырьков. При слишком высокой оптической плотности разведите образец, измерьте снова и укажите полный коэффициент разведения. Он равен исходной концентрации, деленной на концентрацию измеренного раствора; для неразведенного образца это единица. Одно значение A260 не доказывает чистоту. Белки, фенол, гуанидиний, свободные нуклеотиды и мутность могут влиять на УФ-показания. В лабораториях часто рассматривают отношения A260 к A280 и A260 к A230 как общие показатели чистоты. Анализы с флуоресцентными красителями могут быть специфичнее при низкой концентрации ДНК или вероятных примесях. Коэффициент пересчета тоже приблизителен; необычные последовательности олигонуклеотидов могут требовать собственных коэффициентов экстинкции. Используйте общую массу для расчета выхода, планирования нормализации или определения количества материала для дальнейшей работы. Это просто концентрация, умноженная на объем, поэтому предполагается однородность образца. Перед чувствительными применениями — секвенированием, клонированием, трансфекцией или количественной ПЦР — соблюдайте требования анализа и рассмотрите подтверждение концентрации методом на другом физическом принципе. Инструмент помогает быстро планировать работу и прозрачно считать, но качество прибора и подготовка образца остаются важнейшими условиями надежного определения количества.