Калькулятор эффективности qPCR

Эффективность количественной ПЦР показывает, насколько увеличивается количество целевой ДНК за каждый цикл амплификации. Обычно ее оценивают по стандартной кривой зависимости Cq или Ct от логарифма начальной концентрации матрицы по основанию 10. Этот калькулятор переводит отрицательный наклон аппроксимирующей прямой в эффективность в процентах, используя стандартную связь между разведением, разницей циклов и коэффициентом амплификации. Наклон около минус 3.322 соответствует коэффициенту два и эффективности примерно 100%: в идеале количество мишени удваивается за каждый цикл. Во многих протоколах qPCR эффективность от 90% до 110% считают в целом приемлемой. Этому интервалу примерно соответствуют наклоны от минус 3.58 до минус 3.10. Однако критерии приемлемости должны соответствовать валидированной методике лаборатории, цели анализа, рекомендациям производителя прибора и применимому стандарту отчетности. Одной эффективности недостаточно, чтобы подтвердить надежность анализа. Стандартная кривая также должна охватывать рабочий диапазон концентраций, включать достаточное число технических повторов и показывать высокую линейность без систематической кривизны остатков. Низкую эффективность могут вызывать несовпадение праймеров с матрицей, неудачный дизайн праймеров, вторичная структура, неоптимальные условия отжига, ингибиторы, неточное разведение, ошибки пипетирования или концентрации за пределами линейного отклика анализа. Эффективность выше 110% часто указывает на неспецифическую амплификацию, димеры праймеров, проблемы с базовой линией или порогом либо ошибки серии разведений, а не на действительно сверхэффективную репликацию. Перед принятием численного результата изучите кривые амплификации и, где применимо, кривые плавления. Используйте наклон регрессии, полученный при принятом здесь расположении осей: Cq по вертикали и log10 начального количества по горизонтали. Перестановка осей или использование натуральных логарифмов дает наклон, несовместимый с этой формулой. Сохраняйте достаточно значащих цифр наклона, поскольку округление может изменить указанную эффективность. Результат представляет собой математическое преобразование и не заменяет проверку корреляции стандартной кривой, разброса повторов, контролей без матрицы, динамического диапазона и специфичности анализа.