qPCR-Effizienz-Rechner

Die Effizienz der quantitativen PCR beschreibt, wie stark die Menge der Ziel-DNA in jedem Amplifikationszyklus zunimmt. Sie wird meist aus einer Standardkurve geschätzt, bei der Cq- oder Ct-Werte gegen den Logarithmus zur Basis 10 der anfänglichen Templatekonzentration aufgetragen werden. Dieser Rechner wandelt die negative Steigung der angepassten Geraden anhand der Standardbeziehung zwischen Verdünnung, Zyklusdifferenz und Amplifikationsfaktor in eine prozentuale Effizienz um. Eine Steigung nahe minus 3.322 entspricht einem Faktor von zwei und ungefähr 100% Effizienz: Die Zielmenge verdoppelt sich idealerweise in jedem Zyklus. In vielen qPCR-Arbeitsabläufen gelten Effizienzen von 90% bis 110% grundsätzlich als akzeptabel. Das entspricht ungefähr Steigungen von minus 3.58 bis minus 3.10. Die Akzeptanzkriterien müssen dennoch zur validierten Labormethode, zum Assayzweck, zu den Gerätehinweisen und zum geltenden Berichtsstandard passen. Effizienz allein belegt keine zuverlässige Analyse. Die Standardkurve sollte auch den Arbeitskonzentrationsbereich abdecken, ausreichend technische Replikate enthalten und eine hohe Linearität mit Residuen ohne systematische Krümmung zeigen. Eine geringe Effizienz kann durch Primerfehlpaarungen, ungünstiges Primerdesign, Sekundärstrukturen, suboptimale Annealingbedingungen, Inhibitoren, ungenaue Verdünnung, Pipettierfehler oder Konzentrationen außerhalb des linearen Antwortbereichs entstehen. Eine Effizienz über 110% deutet häufig auf unspezifische Amplifikation, Primerdimere, Probleme mit Basislinie oder Schwellenwert oder Fehler in der Verdünnungsreihe hin, nicht auf tatsächlich übermäßig effiziente Replikation. Prüfen Sie die Amplifikationskurven und gegebenenfalls die Schmelzkurven, bevor Sie das numerische Ergebnis akzeptieren. Verwenden Sie eine Regressionssteigung mit derselben Achsenkonvention wie hier: Cq auf der vertikalen Achse und log10 der Ausgangsmenge auf der horizontalen Achse. Vertauschte Achsen oder natürliche Logarithmen liefern eine Steigung, die nicht zu dieser Formel passt. Behalten Sie genügend signifikante Stellen der angepassten Steigung bei, da Rundung die ausgegebene Effizienz verändern kann. Das Ergebnis ist eine mathematische Umrechnung und ersetzt nicht die Prüfung von Standardkurvenkorrelation, Replikatstreuung, Kontrollen ohne Template, dynamischem Bereich und Assayspezifität.