DNA-Ligationsrechner

Bei der DNA-Ligation verbindet eine DNA-Ligase Vektor und Insert. Für den erfolgreichen Zusammenbau zählt jedoch die Molekülzahl, nicht allein die Masse. Ein kurzes Insert enthält pro Nanogramm deutlich mehr Moleküle als ein langer Vektor. Dieser Rechner berücksichtigt den Unterschied anhand der Fragmentlängen und des gewählten molaren Insert-Vektor-Verhältnisses. Er multipliziert die Vektormasse mit der Insertlänge geteilt durch die Vektorlänge und anschließend mit dem gewünschten Verhältnis. Das Ergebnis ist die Insertmasse für die eingegebene Vektormasse. Ein Insert-Vektor-Verhältnis von drei zu eins ist ein üblicher Ausgangspunkt für die Klonierung mit kohäsiven Enden, da Insertmoleküle häufiger auf geöffnete Vektormoleküle treffen können. Für stumpfe Enden, schwierige Inserts oder spezielle Kits kann ein anderes Verhältnis günstiger sein. Eins zu eins eignet sich als Vergleich. Höhere Verhältnisse können die Insertion fördern, aber auch mehrere Inserts oder unerwünschte Produkte begünstigen. Maßgeblich sind das Protokoll des Ligaseanbieters und die Einschränkungen der Klonierungsmethode. Die Pikomol-Schätzung verwendet eine mittlere molare Masse von 650 Gramm pro Mol je Basenpaar doppelsträngiger DNA. Diese Werte dienen der Planung und sind keine direkten Messungen. Eine genaue Fragmentkonzentration ist wichtig: Verwenden Sie eine geeignete fluorometrische oder absorbanzbasierte Methode und berücksichtigen Sie Salze, Nukleotide und Verunreinigungen. Die Fragmentlängen müssen die tatsächlich ligierten Produkte umfassen, nicht nur die gewünschte codierende Sequenz. Die Reaktionsleistung hängt außerdem von kompatiblen Enden, Phosphorylierung, Vektordephosphorylierung, DNA-Reinheit, frischem Puffer, ATP, Ligaseaktivität, Temperatur und Inkubationszeit ab. Bei der Fehlersuche sind geeignete Positivkontrollen, Kontrollen mit Vektor allein und ohne Ligase nötig. Die berechneten Mengen legen die Stöchiometrie fest, sagen aber weder Transformationseffizienz noch Koloniequalität voraus. Überschreitet die gesamte DNA-Menge die Kit-Empfehlung, reduzieren Sie beide Komponenten bei gleichbleibendem molarem Verhältnis. Testen Sie bei wertvollen Proben zwei oder drei benachbarte Verhältnisse parallel und vergleichen Sie bestätigte rekombinante Kolonien statt nur die Koloniezahl.