Калькулятор лигирования ДНК

При лигировании ДНК лигаза соединяет вектор со вставкой, но успех сборки зависит от числа молекул, а не только от массы. В одном нанограмме короткой вставки гораздо больше молекул, чем в той же массе длинного вектора. Калькулятор учитывает это различие по длинам фрагментов и выбранному молярному соотношению вставки и вектора. Масса вектора умножается на длину вставки, делённую на длину вектора, а затем на нужное соотношение. Результат — масса вставки для указанной массы вектора. Соотношение вставки и вектора три к одному — обычная отправная точка при клонировании по липким концам: молекулы вставки чаще встречаются с разомкнутыми молекулами вектора. Для тупых концов, сложных вставок или специальных наборов может подойти другое соотношение. Один к одному полезно для сравнения. Более высокие соотношения иногда улучшают включение вставки, но могут способствовать множественным вставкам и нежелательным продуктам. Следуйте протоколу поставщика лигазы и ограничениям метода клонирования. Для оценки пикомолей используется средняя молярная масса 650 граммов на моль на каждую пару оснований двуцепочечной ДНК. Это расчётные ориентиры, а не прямые измерения. Важна точная концентрация фрагментов: применяйте подходящий флуориметрический метод или измерение поглощения, учитывая соли, нуклеотиды и примеси. Длины должны включать реально лигируемые продукты, а не только намеченную кодирующую последовательность. Эффективность реакции также зависит от совместимости концов, фосфорилирования, дефосфорилирования вектора, чистоты ДНК, свежести буфера, ATP, активности лигазы, температуры и времени инкубации. При поиске причин неудачи включайте положительный контроль, контроль только с вектором и без лигазы. Расчёт задаёт стехиометрию, но не предсказывает эффективность трансформации или качество колоний. Если суммарная ДНК превышает рекомендацию набора, уменьшите оба компонента, сохранив молярное соотношение. Для ценных образцов параллельно проверьте два-три близких соотношения и сравнивайте подтверждённые рекомбинантные колонии, а не только их число.