DNAライゲーション計算機

DNAライゲーションはDNAリガーゼでベクターとインサートを結合する反応ですが、組み立ての成否を左右するのは質量だけでなく分子数です。短いインサートは、長いベクターよりもナノグラム当たりの分子数が大幅に多くなります。この計算機は断片長と指定したインサート対ベクターのモル比でその差を補正します。ベクター質量にインサート長をベクター長で割った値を掛け、さらに目的の比率を掛けると、入力したベクター量に加えるインサート質量が得られます。 通常の粘着末端クローニングでは、インサート対ベクターを三対一にするのが一般的な出発点です。インサート分子が開いたベクター分子と出会う機会が増えるためです。平滑末端の結合、扱いにくいインサート、専用キットでは別の比率が適することもあります。一対一は比較に役立ち、高い比率は挿入を促す場合がある一方、多重挿入や不要な産物も増やしかねません。リガーゼ供給元の手順とクローニング法の制約に従って設定してください。 ピコモル量の推定には、二本鎖DNAの塩基対当たりの平均モル質量を650グラム毎モルと仮定しています。計画に便利な推定値であり、直接測定した値ではありません。断片濃度は正確であることが重要なので、適切な蛍光法や吸光度法を用い、塩、ヌクレオチド、混入物の影響を考慮してください。断片長には目的のコード配列だけでなく、実際に結合される産物全体を含めます。 反応効率は末端の適合性、リン酸化、ベクターの脱リン酸化、DNA純度、バッファーの鮮度、ATP、リガーゼ活性、温度、反応時間にも左右されます。問題の切り分けには陽性対照、ベクターのみ、リガーゼなしの適切な対照を含めてください。計算量は化学量論の設定には役立ちますが、形質転換効率やコロニーの品質は予測できません。総DNA量がキットの推奨を超える場合は、モル比を保って両成分を減らします。貴重な試料では近い比率を二、三種類並行して試し、コロニー数だけでなく、確認済みの組換えコロニーを比較してください。