Calculadora de eficiencia de qPCR

La eficiencia de la PCR cuantitativa describe cuánto ADN diana se acumula en cada ciclo de amplificación. Suele estimarse mediante una curva estándar que representa los valores Cq o Ct frente al logaritmo en base 10 de la concentración inicial de la plantilla. Esta calculadora convierte la pendiente negativa de la recta ajustada en un porcentaje de eficiencia mediante la relación estándar entre dilución, diferencia de ciclos y factor de amplificación. Una pendiente próxima a menos 3.322 corresponde a un factor de dos y una eficiencia aproximada del 100%, lo que significa que, idealmente, la cantidad diana se duplica en cada ciclo. Muchos procedimientos de qPCR consideran generalmente aceptables eficiencias del 90% al 110%. Ese intervalo corresponde aproximadamente a pendientes entre menos 3.58 y menos 3.10. Aun así, los criterios de aceptación deben seguir el método validado del laboratorio, la finalidad del ensayo, las indicaciones del instrumento y la norma de presentación de resultados aplicable. La eficiencia por sí sola no basta para establecer la fiabilidad de un ensayo. La curva estándar también debe cubrir el intervalo de concentraciones de trabajo, incluir suficientes réplicas técnicas y mostrar una buena linealidad, con residuos sin curvatura sistemática. Una eficiencia deficiente puede deberse a desajustes de los cebadores, un diseño inadecuado, estructuras secundarias, condiciones de hibridación subóptimas, inhibidores, diluciones imprecisas, errores de pipeteo o un intervalo de concentraciones que exceda la respuesta lineal del ensayo. Una eficiencia superior al 110% suele indicar amplificación inespecífica, dímeros de cebadores, problemas de línea de base o umbral, o errores en la serie de diluciones, no una replicación realmente supereficiente. Revisa las curvas de amplificación y, cuando corresponda, las de fusión antes de aceptar el resultado numérico. Utiliza la pendiente de regresión obtenida con la misma convención de ejes que se supone aquí: Cq en el eje vertical y log10 de la cantidad inicial en el horizontal. Invertir los ejes o usar logaritmos naturales genera una pendiente incompatible con esta fórmula. Conserva suficientes cifras significativas de la pendiente ajustada, ya que el redondeo puede modificar la eficiencia informada. El resultado es una conversión matemática, no un sustituto de revisar la correlación de la curva estándar, la variación entre réplicas, los controles sin plantilla, el intervalo dinámico y la especificidad del ensayo.