PCR退火溫度計算器
使用Wallace規則、GC含量公式或最近鄰熱力學方法，依引子DNA序列計算最佳PCR退火溫度。
輸入正向引子序列（也可輸入反向引子），設定鹽濃度與DNA濃度，選擇計算方法，即可立即取得建議退火溫度。
PCR退火溫度計算器
使用Wallace規則、GC含量公式或最近鄰熱力學方法，依引子DNA序列計算最佳PCR退火溫度。
關於退火溫度計算器
退火溫度計算器會根據一對寡核苷酸引子的DNA序列與反應條件，預測最佳PCR退火溫度（Ta）。設定正確的退火溫度是PCR實驗設計中最重要的決策之一：溫度過低會產生非特異性產物；溫度過高則會使引子無法有效結合，導致產量下降甚至完全無法擴增。此計算器透過套用成熟的熱力學模型消除猜測，讓你在使用熱循環儀前取得可靠的起始條件。
引子的熔解溫度（Tm）是指一半引子-模板雙股解離成單股時的溫度。退火溫度通常設定為引子對中較低Tm以下5°C，即：Ta = min(Tm_forward, Tm_reverse) − 5°C。此規則兼顧特異性結合與高效延伸，也是全球多數分子生物學實驗室採用的慣例。
本計算器提供三種Tm預測方法，準確度與適用性各不相同。Wallace規則（Tm = 2°C × (A+T) + 4°C × (G+C)）是最簡單且最快的估算方法。它對短於約20個鹼基的引子相當準確，也適合快速合理性檢查，但會忽略最近鄰堆疊交互作用，且未進行鹽校正。需要快速粗略估計時可使用此方法。
GC含量法（Tm = 69.3 + 41 × GC_fraction − 650/n）是Marmur-Doty-Schildkraut公式針對短寡核苷酸的改寫版本。它納入引子長度（n）與GC比例，在18–30個鹼基的典型引子長度範圍內比Wallace規則更準確。不過它仍是近似法，因為它將同類型鹼基對視為熱力學等價。
最近鄰法（SantaLucia 1998）是最準確的方法，也是Primer3、OligoCalc等商用引子設計工具採用的方法。它沿著引子逐一加總相鄰二核苷酸對的焓與熵貢獻來計算ΔH與ΔS，接著套用熱力學公式 Tm = ΔH / (ΔS + R × ln(CT)) − 273.15，其中R為氣體常數，CT為總股濃度。之後再使用公式 Tm_corrected = Tm + 16.6 × log10([Na+]/1000) 進行鹽校正。對任何長度與GC含量的引子而言，尤其是明顯偏離平均組成的高GC或高AT序列，此方法都是黃金標準。
鹽濃度很重要，因為一價陽離子會中和帶負電的磷酸基團之間的排斥，進而穩定DNA雙股。鹽濃度越高，Tm越高；鹽濃度越低，Tm越低。預設鹽值50 mM Na⁺適用於標準PCR緩衝液。DNA（引子）濃度會透過最近鄰公式中的ln(CT)項影響Tm；預設250 nM是PCR反應中的常用值。依實際反應條件調整這些數值可提升預測準確度。
PCR退火溫度範例
示例引子序列展示不同GC組成與長度範圍，並涵蓋三種計算方法。
| 引子序列 | Ta（°C） | 詳細資訊 |
|---|---|---|
| ATGGAGCTGAAGCAGCAGATCC（22 bp，54.5% GC） | Ta ≈ 58°C | 標準基因擴增引子。最近鄰法。鹽50 mM，引子250 nM。 |
| GCGCGCGGATCCATGAAGCTG（21 bp，71.4% GC） | Ta ≈ 67°C | 高GC引子；需要較高的退火溫度。GC含量法。鹽75 mM。 |
| ATCGATCGATCG（12 bp，50% GC） | Ta ≈ 31°C | 短引子，Wallace規則。Ta = 2(6) + 4(6) − 5 = 31°C。短引子需要較低Ta。 |
| TTGACGATCATGAGCTTGGC（20 bp，50% GC） | Ta ≈ 52°C | 低鹽條件（25 mM）。與50 mM標準條件相比，較低鹽濃度會降低Tm。 |
如何使用退火溫度計算器
- 在第一個欄位輸入正向引子DNA序列（5’到3’方向）。僅使用ATGC鹼基；模糊鹼基與空格會被忽略。
- 可選擇輸入反向引子序列。若有提供，Ta會依匹配引子對中較低的Tm值計算。
- 設定鹽濃度（預設50 mM NaCl）與DNA/引子濃度（預設250 nM）。為獲得最佳準確度，請使用實際反應條件。
- 選擇計算方法：Wallace規則用於快速粗略估計，GC含量法用於中等準確度，最近鄰法（SantaLucia 1998）用於最準確結果。
- 按一下計算溫度。結果面板會顯示建議退火溫度（Ta），以及每條引子的個別Tm值與鹼基組成統計。
退火溫度計算器常見問題
Tm和Ta有什麼差異？
Tm（熔解溫度）是50%的引子-模板雙股解離成單股時的溫度，它是引子本身與反應條件的特性。Ta（退火溫度）是PCR熱循環儀在退火步驟中使用的溫度。Ta通常設定為引子對中較低Tm以下5°C，以確保引子有效且特異地結合。
我應該使用哪種計算方法？
對多數實驗室PCR而言，最近鄰法（SantaLucia 1998）最準確，也是NCBI Primer-BLAST與Primer3建議的方法。Wallace規則僅適用於很短的引子（少於14個鹼基）或快速粗略檢查。若想要比Wallace更準確但仍比NN更快，例如初步篩選引子時，可使用GC含量法。
為什麼使用計算出的退火溫度後PCR仍然失敗？
計算出的Ta只是起點，不是保證。實際PCR表現也取決於引子特異性（用BLAST檢查）、引子二聚體與髮夾結構（用OligoAnalyzer檢查）、模板二級結構、Mg2⁺濃度、聚合酶持續合成能力，以及熱循環儀升降溫速率。如果計算溫度無效，可嘗試以Ta為中心、範圍±2–10°C的梯度PCR，或以2°C為步階降低退火溫度。
鹽濃度如何影響退火溫度？
較高的一價鹽（Na⁺、K⁺）濃度會屏蔽帶負電的磷酸骨架，穩定DNA雙螺旋並提高Tm。NaCl從25 mM增加到100 mM通常會使Tm升高2–3°C。標準PCR緩衝液含50–75 mM KCl和Mg2⁺；使用最近鄰鹽校正時，請輸入Na⁺等效濃度以獲得最佳結果。
如果兩條引子的Tm差異很大，該怎麼辦？
當一對引子的Tm相差超過5°C時，建議重新設計較低Tm的引子，使其更長或GC含量更高，以拉近兩者數值。較大的Tm不匹配會使其中一條引子在所選Ta下結合效率較低，降低產量並促進單側產物生成。作為折衷，有時可使用touch-down PCR流程，從高於較高Tm的溫度開始，並逐步降至退火溫度範圍。
有DMSO或其他添加劑時，引子Tm會改變嗎？
會。DMSO會使雙螺旋不穩定並降低Tm，通常每加入1% DMSO會降低約0.5–1.0°C。甜菜鹼、甘油和甲醯胺也會類似地降低Tm。這些添加劑用於擴增高GC或結構複雜的模板；存在這些添加劑時，應將Ta降低約相同幅度。本計算器不模擬添加劑效應，因此若反應含有共溶劑，請手動調整Ta。