Calculadora de eficiência de qPCR

A eficiência da PCR quantitativa descreve quanto DNA-alvo se acumula em cada ciclo de amplificação. Geralmente é estimada por uma curva padrão que relaciona valores de Cq ou Ct ao logaritmo de base 10 da concentração inicial do molde. Esta calculadora converte a inclinação negativa da reta ajustada em eficiência percentual usando a relação padrão entre diluição, diferença de ciclos e fator de amplificação. Uma inclinação próxima de menos 3.322 corresponde a um fator de dois e a aproximadamente 100% de eficiência, ou seja, idealmente a quantidade-alvo dobra em cada ciclo. Muitos fluxos de trabalho de qPCR consideram eficiências de 90% a 110% amplamente aceitáveis. Esse intervalo corresponde aproximadamente a inclinações de menos 3.58 a menos 3.10. Ainda assim, os critérios de aceitação devem seguir o método validado do laboratório, a finalidade do ensaio, as orientações do equipamento e a norma aplicável de relato de resultados. A eficiência isolada não basta para estabelecer a confiabilidade do ensaio. A curva padrão também deve cobrir a faixa de concentração de trabalho, incluir réplicas técnicas suficientes e apresentar boa linearidade, com resíduos sem curvatura sistemática. A baixa eficiência pode resultar de incompatibilidade dos primers, desenho inadequado, estruturas secundárias, condições de anelamento abaixo do ideal, inibidores, diluição imprecisa, erro de pipetagem ou concentrações que excedam a resposta linear do ensaio. Uma eficiência acima de 110% costuma indicar amplificação inespecífica, dímeros de primers, problemas de linha de base ou limiar, ou erros na série de diluições, em vez de uma replicação realmente supereficiente. Revise as curvas de amplificação e, quando aplicável, as curvas de dissociação antes de aceitar o resultado numérico. Use a inclinação de regressão obtida com a mesma convenção de eixos adotada aqui: Cq no eixo vertical e log10 da quantidade inicial no horizontal. Inverter os eixos ou usar logaritmos naturais produz uma inclinação incompatível com esta fórmula. Mantenha algarismos significativos suficientes da inclinação ajustada, pois o arredondamento pode alterar a eficiência informada. A saída é uma conversão matemática, não um substituto para verificar a correlação da curva padrão, a variação entre réplicas, os controles sem molde, a faixa dinâmica e a especificidade do ensaio.