Calculadora de ligação de DNA

A ligação de DNA une vetor e inserto com DNA ligase, mas o sucesso da montagem depende do número de moléculas, não apenas da massa. Um inserto curto contém muito mais moléculas por nanograma do que um vetor longo. Esta calculadora corrige essa diferença usando o comprimento dos fragmentos e a razão molar inserto-vetor selecionada. Ela multiplica a massa do vetor pelo comprimento do inserto dividido pelo comprimento do vetor e, depois, pela razão desejada. O resultado é a massa de inserto a combinar com a massa de vetor informada. Uma razão inserto-vetor de três para um é um ponto de partida comum na clonagem com extremidades coesivas, pois aumenta as oportunidades de encontro entre moléculas de inserto e vetor aberto. Ligações de extremidades cegas, insertos difíceis ou kits especializados podem funcionar melhor com outra razão. Um para um serve como comparação; razões maiores podem melhorar a inserção, mas também favorecer múltiplos insertos ou produtos indesejados. Siga o protocolo do fornecedor da ligase e as limitações do método de clonagem. A estimativa em picomoles usa uma massa molar média de 650 gramas por mol para cada par de bases de DNA de fita dupla. São valores úteis para planejamento, não medições diretas. A concentração precisa dos fragmentos é importante: use um método fluorométrico ou de absorbância adequado e considere sais, nucleotídeos e contaminantes. Confirme que os comprimentos incluem os produtos realmente ligados, e não apenas a sequência codificante desejada. O desempenho também depende de extremidades compatíveis, fosforilação, desfosforilação do vetor, pureza do DNA, tampão fresco, ATP, atividade da ligase, temperatura e tempo de incubação. Na investigação de problemas, inclua controles positivos, somente com vetor e sem ligase. As quantidades calculadas estabelecem a estequiometria, mas não preveem a eficiência de transformação nem a qualidade das colônias. Se o DNA total exceder a recomendação do kit, reduza ambos os componentes mantendo a razão molar. Para amostras valiosas, teste duas ou três razões próximas em paralelo e compare colônias recombinantes verificadas, não apenas a contagem de colônias.