Calculadora de número de cópias de DNA

O número de cópias de DNA converte uma massa medida em uma estimativa de moléculas físicas. Os fluxos de biologia molecular frequentemente precisam dessa conversão porque os instrumentos informam concentração ou massa, enquanto as reações dependem da quantidade de moléculas-molde presentes. Padrões de PCR quantitativa, planejamento de PCR digital, clonagem, bibliotecas de sequenciamento, experimentos de transfecção e controles sintéticos podem aproveitar uma estimativa transparente de massa para moléculas. O cálculo considera que um par de bases de DNA de fita dupla tem massa molar média de 660 gramas por mol. Multiplicar o comprimento em pares de bases por 660 fornece a massa molar aproximada de uma molécula de DNA. A massa informada é convertida para gramas, dividida por esse peso molecular para obter mols e multiplicada pela constante exata de Avogadro, 6.02214076 vezes dez elevado a vinte e três. Nesse modelo, dez nanogramas de um plasmídeo de 5,000 pares de bases contêm cerca de 1.825 bilhão de moléculas. O comprimento tem relação inversa com o número de cópias. Na mesma massa, um amplicon de 1,000 pares de bases tem cinco vezes mais moléculas que um plasmídeo de 5,000 pares de bases, pois cada molécula pesa cerca de um quinto. A massa tem relação direta: dobrar a massa dobra as cópias estimadas. O comprimento informado deve representar toda a molécula contada. Para plasmídeos circulares, use o comprimento total, incluindo vetor e inserto, não apenas o alvo amplificado. A resposta é uma estimativa porque 660 gramas por mol por par de bases é uma média. O peso molecular exato varia ligeiramente com sequência, extremidades, modificações e a condição de fita simples. Esta calculadora é destinada a DNA de fita dupla. Medidas de concentração também têm incerteza, e contaminantes podem fazer métodos de absorbância superestimarem a massa. Ensaios fluorescentes podem melhorar a especificidade, enquanto pipetagem e diluição precisas são essenciais na preparação de padrões com poucas cópias. Para converter concentração em cópias por microlitro, informe a massa presente em um microlitro. Por exemplo, dez nanogramas por microlitro correspondem à entrada de dez nanogramas; a saída será cópias por microlitro. Multiplique pelo volume de reação apenas quando precisar do total de moléculas adicionadas. Prepare padrões com consumíveis de baixa adsorção, mistura completa, carreador apropriado e diluições replicadas, pois adsorção e erros de pipetagem importam em concentrações muito baixas. O valor calculado é um ponto de partida teórico sólido, mas o controle de qualidade experimental determina a confiabilidade da quantificação posterior.