Calculateur d'efficacité qPCR

L'efficacité de la PCR quantitative décrit l'accumulation d'ADN cible à chaque cycle d'amplification. Elle est généralement estimée à partir d'une courbe étalon représentant les valeurs Cq ou Ct en fonction du logarithme en base 10 de la concentration initiale de matrice. Ce calculateur convertit la pente négative de la droite ajustée en pourcentage d'efficacité à l'aide de la relation standard entre dilution, différence de cycles et facteur d'amplification. Une pente proche de moins 3.322 correspond à un facteur de deux et à une efficacité d'environ 100%, soit un doublement idéal de la quantité cible à chaque cycle. De nombreux protocoles de qPCR considèrent les efficacités de 90% à 110% comme globalement acceptables. Cet intervalle correspond approximativement à des pentes de moins 3.58 à moins 3.10. Les critères d'acceptation doivent néanmoins respecter la méthode validée du laboratoire, l'objectif de l'essai, les recommandations de l'instrument et la norme de compte rendu applicable. L'efficacité seule ne suffit pas à établir la fiabilité d'un essai. La courbe étalon doit aussi couvrir la plage de concentrations de travail, comporter suffisamment de réplicats techniques et présenter une bonne linéarité, avec des résidus sans courbure systématique. Une mauvaise efficacité peut provenir d'un mésappariement des amorces, d'une conception inadaptée, de structures secondaires, de conditions d'hybridation sous-optimales, d'inhibiteurs, d'une dilution imprécise, d'erreurs de pipetage ou de concentrations dépassant la réponse linéaire de l'essai. Une efficacité supérieure à 110% signale souvent une amplification non spécifique, des dimères d'amorces, des problèmes de ligne de base ou de seuil, ou des erreurs dans la série de dilutions, plutôt qu'une réplication réellement surperformante. Examinez les courbes d'amplification et, le cas échéant, les courbes de fusion avant d'accepter le résultat numérique. Utilisez la pente de régression obtenue avec la convention d'axes retenue ici : Cq en ordonnée et log10 de la quantité initiale en abscisse. Inverser les axes ou utiliser des logarithmes naturels produit une pente incompatible avec cette formule. Conservez suffisamment de chiffres significatifs de la pente ajustée, car l'arrondi peut modifier l'efficacité indiquée. Le résultat est une conversion mathématique, qui ne remplace pas l'examen de la corrélation de la courbe étalon, de la variation entre réplicats, des témoins sans matrice, de la plage dynamique et de la spécificité de l'essai.