Calculadora del número de copias de ADN

El número de copias de ADN convierte una masa medida en una estimación de moléculas físicas. Los flujos de biología molecular suelen necesitar esta conversión porque los instrumentos informan de concentración o masa, mientras las reacciones dependen de cuántas moléculas molde hay. Los estándares de PCR cuantitativa, la planificación de PCR digital, la clonación, las bibliotecas de secuenciación, los experimentos de transfección y los controles sintéticos pueden beneficiarse de una estimación transparente de masa a moléculas. El cálculo asigna a cada par de bases de ADN de doble cadena una masa molar media de 660 gramos por mol. Multiplicar la longitud en pares de bases por 660 da la masa molar aproximada de una molécula de ADN. La masa introducida se convierte a gramos, se divide entre ese peso molecular para obtener moles y se multiplica por la constante exacta de Avogadro, 6.02214076 por diez elevado a veintitrés. Según este modelo, diez nanogramos de un plásmido de 5,000 pares de bases contienen unas 1.825 mil millones de moléculas. La longitud es inversamente proporcional al número de copias. A igual masa, un amplicón de 1,000 pares de bases tiene cinco veces más moléculas que un plásmido de 5,000 pares de bases, pues cada molécula pesa aproximadamente una quinta parte. La masa tiene una relación directa: duplicarla duplica las copias estimadas. La longitud debe representar la molécula completa que se cuenta. Para un plásmido circular, usa la longitud total, incluidos vector e inserto, no solo la diana amplificada. El resultado es estimado porque 660 gramos por mol y par de bases es una media. El peso molecular exacto varía ligeramente con la secuencia, los extremos, las modificaciones y si el material es monocatenario. Esta calculadora está destinada a ADN de doble cadena. Las mediciones de concentración también tienen incertidumbre, y los contaminantes pueden hacer que los métodos de absorbancia sobreestimen la masa. Los ensayos fluorescentes pueden mejorar la especificidad, y pipetear y diluir correctamente es esencial al preparar estándares de pocas copias. Para obtener copias por microlitro a partir de una concentración, introduce la masa presente en un microlitro. Una concentración de diez nanogramos por microlitro implica introducir diez nanogramos; la salida será copias por microlitro. Multiplica por el volumen de reacción solo si necesitas el total de moléculas añadidas. Prepara los estándares con consumibles de baja adsorción, mezcla completa, un portador adecuado y diluciones replicadas, porque la adsorción y el error de pipeteo importan a concentraciones muy bajas. El valor calculado ofrece un punto de partida teórico sólido, pero el control de calidad experimental determina la fiabilidad de la cuantificación posterior.