DNA连接计算器

DNA连接通过DNA连接酶将载体与插入片段连接起来，但组装能否成功取决于分子数量，而不只是质量。每纳克短插入片段所含的分子数远多于长载体。本计算器利用片段长度和选定的插入片段与载体摩尔比校正这一差异：将载体质量乘以插入片段长度与载体长度之比，再乘以目标摩尔比，得到与所输入载体质量搭配的插入片段质量。 对于常规黏性末端克隆，插入片段与载体三比一通常是起始比例，因为它使插入片段分子有更多机会接触线性化载体。平末端连接、难连接的片段或专用试剂盒可能适合其他比例。一比一可作为对照；提高比例有时能促进插入，但也可能造成多个片段插入或非预期产物。具体设置应遵循连接酶供应商的操作方案和克隆方法的限制。 皮摩尔量估算采用双链DNA每个碱基对平均摩尔质量为650克每摩尔的假设。这些数值便于规划，并非直接测量结果。片段浓度准确与否很重要，应采用合适的荧光或吸光度测定方法，并考虑盐、核苷酸及污染物的影响。务必使用实际参与连接的完整片段长度，而非仅使用目标编码序列长度。 反应效果还取决于末端兼容性、磷酸化、载体去磷酸化、DNA纯度、缓冲液新鲜度、ATP、连接酶活性、温度和孵育时间。排查问题时应设置适当的阳性、仅载体和无连接酶对照。计算用量有助于确定化学计量关系，但不能预测转化效率或菌落质量。如果总DNA量超过试剂盒建议值，应按比例缩减两种组分，同时保持摩尔比。对于珍贵样本，可平行测试两到三个相近比例，比较经验证的重组菌落，而不只看菌落数量。