Calculateur de ligation de l'ADN

La ligation de l'ADN réunit un vecteur et un insert grâce à une ADN ligase, mais la réussite de l'assemblage dépend du nombre de molécules, pas seulement de leur masse. Un insert court contient bien plus de molécules par nanogramme qu'un vecteur long. Ce calculateur corrige cette différence à partir des longueurs et du rapport molaire insert-vecteur choisi. Il multiplie la masse du vecteur par la longueur de l'insert divisée par celle du vecteur, puis par le rapport souhaité. Le résultat est la masse d'insert à associer à la masse de vecteur saisie. Un rapport insert-vecteur de trois pour un est un point de départ courant en clonage à extrémités cohésives : il favorise les rencontres entre les molécules d'insert et de vecteur ouvert. Les extrémités franches, les inserts difficiles ou les kits spécialisés peuvent nécessiter un autre rapport. Un rapport de un pour un sert de comparaison ; des rapports plus élevés peuvent améliorer l'insertion, mais aussi favoriser des inserts multiples ou des produits indésirables. Respectez le protocole du fournisseur de ligase et les contraintes de la méthode de clonage. L'estimation en picomoles utilise une masse molaire moyenne de 650 grammes par mole pour chaque paire de bases d'ADN double brin. Ces valeurs facilitent la préparation, sans constituer des mesures directes. Une concentration précise est essentielle : employez une méthode fluorométrique ou d'absorbance adaptée et tenez compte des sels, nucléotides et contaminants. Vérifiez que les longueurs correspondent aux produits réellement ligaturés, et pas uniquement à la séquence codante visée. Le rendement dépend aussi de la compatibilité des extrémités, de la phosphorylation, de la déphosphorylation du vecteur, de la pureté de l'ADN, de la fraîcheur du tampon, de l'ATP, de l'activité de la ligase, de la température et du temps d'incubation. Pour résoudre un problème, incluez des témoins positifs, avec vecteur seul et sans ligase. Les quantités calculées définissent la stœchiométrie, mais ne prédisent ni l'efficacité de transformation ni la qualité des colonies. Si l'ADN total dépasse les recommandations du kit, réduisez les deux composants en conservant le rapport molaire. Pour des échantillons précieux, testez en parallèle deux ou trois rapports proches et comparez les colonies recombinantes vérifiées, pas seulement leur nombre.