Calculadora de ligación de ADN

La ligación de ADN une un vector y un inserto mediante ADN ligasa, pero el éxito del ensamblaje depende del número de moléculas, no solo de la masa. Un inserto corto contiene muchas más moléculas por nanogramo que un vector largo. Esta calculadora corrige esa diferencia mediante la longitud de los fragmentos y la relación molar inserto-vector elegida. Multiplica la masa del vector por la longitud del inserto dividida entre la longitud del vector, y después por la relación deseada. El resultado es la masa de inserto que se debe combinar con la masa de vector introducida. Una relación inserto-vector de tres a uno es un punto de partida habitual en la clonación con extremos cohesivos, ya que aumenta las oportunidades de encuentro entre el inserto y el vector abierto. Las ligaciones de extremos romos, los insertos difíciles o los kits especializados pueden requerir otra relación. Una relación de uno a uno sirve de comparación; las relaciones mayores pueden favorecer la inserción, pero también los insertos múltiples o productos no deseados. Sigue el protocolo del proveedor de la ligasa y las limitaciones del método de clonación. Los picomoles se estiman con una masa molar media de 650 gramos por mol por cada par de bases de ADN bicatenario. Son valores orientativos, no mediciones directas. La concentración debe ser precisa: utiliza un método fluorométrico o de absorbancia adecuado y considera las sales, los nucleótidos y los contaminantes. Comprueba que las longitudes incluyan los productos que realmente se ligarán, no solo la secuencia codificante prevista. El rendimiento también depende de la compatibilidad de extremos, la fosforilación, la desfosforilación del vector, la pureza del ADN, la frescura del tampón, el ATP, la actividad de la ligasa, la temperatura y el tiempo de incubación. Al resolver problemas, incluye controles positivos, de vector solo y sin ligasa. Las cantidades calculadas establecen la estequiometría, pero no predicen la eficiencia de transformación ni la calidad de las colonias. Si el ADN total supera lo recomendado por el kit, reduce ambos componentes conservando la relación molar. Para muestras valiosas, prueba en paralelo dos o tres relaciones cercanas y compara colonias recombinantes verificadas, no solo el número de colonias.